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SILACタンパク質発現・相対定量解析サービス
SILACタンパク質発現・相対定量解析サービスは、安定同位体アミノ酸で一定期間培養した細胞を用いて、培養細胞中のタンパク質の同定、及び、発現量の相対定量(比較定量)を行うサービスです。解析結果として、関連するパスウェイ情報と共に、同定されたタンパク質の一覧及びタンパク質の発現量の相対定量データをお届けします。


SILAC解析の概要

SILAC(Stable Isotope Labeling using Amino Acids in Cell Culture)細胞培養液中のアミノ酸を用いた安定同位体ラベルは、複雑なタンパク質サンプル中のタンパク質の同定と、発現量の比較定量を可能とする手法です。SILAC法では、細胞培養時に13Cあるいは、15Nでラベルされたアミノ酸を代謝的にタンパク質に導入したサンプルを調整し、質量分析計(ThermoFisher Orbitrap Velos Pro tandem mass spectrometer, Q Exactive is a hybrid quadrupole-Orbitrap mass spectrometer)により、タンパク質の同定と相対定量を行います。

【特徴】
細胞中のタンパク質をほぼ100%ラベル
異なる処理を施した細胞間のタンパク質発現を比較定量(2又は3サンプル)
数百から数千のタンパク質を1回の実験で同定及び比較定量
サンプル処理の初期段階でサンプルを混合することで定量精度が向上
リジンとアルギニンを用いることで様々な解析に対応
DMEMまたはRPMI1640培地を用いる幅広い哺乳類細胞で利用可能(HeLa, 293T, COS7, U2OS, A549, A431, HepG2, NIH3T3, Jurkatなど)

SILAC法では、12C6または、13C6 L-lysineの様な軽い(light)または重い(heavy)必須アミノ酸を含む培地で哺乳類細胞を培養します。一般的に、軽いアミノ酸を含む培地の細胞と、重いアミノ酸を含む培地の細胞を、それぞれコントロール及び実験サンプルとして用います。軽いアミノ酸と重いアミノ酸は、細胞培養時に天然の細胞内タンパク質合成経路により、タンパク質中に導入(ラベル)されます。
ラベルされた細胞サンプルの一方について、化学的処理や遺伝子操作を行い、プロテオームを変化させた後、両方の細胞からタンパク質を抽出し、等量ずつ混合します。混合サンプルは、SDS-PAGEを用いて分離し、40にセグメンテーションし、還元アルキル化及びトリプシン消化して、Nano LC/MS/MSにより分析します。軽いアミノ酸及び重いアミノ酸でラベルされたペプチドは、化学的に同一であるため、逆相クロマトグラフィーにおいて同時に溶出され、同時にMS分析されます。得られたMSスペクトルにおける、軽いおよび重いタンパク質に由来するペプチドのピーク強度の比率から、実験サンプル中のタンパク質の発現量変化を評価します。
SILAC解析の流れ


サンプル準備 (細胞)
標識の取り込み
標識されたアミノ酸の取り込み (細胞への標識取り込みは98%以上)
弊社へサンプル発送
上記で調整した細胞を、ペレットで弊社へ発送(ドライアイス詰めで冷凍便:-80℃)
QCシートをご記入の上、添付してください。
SDS-PAGE
コロイドのクマシー染色したInvitrogen社のNovex mini-gelsにより泳動
セグメンテーション
セグメント数は40セグメント
試料分解
還元アルキル化及び、トリプシン消化
Nano LC/MS/MS
250nL/minの液体クロマトグラフィー、Orbitrap Velos Pro or Q Exactiveタンデム質量分析計
データ分析
MaxQuantを用いて統合されたピーク面積に基づく比較定量及びノーマライゼーションを行う。タンパク質同定は、Mascot Statiaticalを用いて行われ、有意差検定を行う。また、オプションにてパスウェイ解析を行う。


レポート
サンプル受領後、約1ヶ月程度で納品いたします。

・PDFレポート
 Project Report, Experimental Methods, Resultsなど
 ⇒データ例(PDF)
・Excelデータ

 Protein IDs, Protein Names, Gene Names, Unique Peptides(seq), Molecular Weight(kDa)など
 Log2 Fold Changeグラフ
 ⇒データ例(Excel)

・Pathway解析データ
 ご希望により、MaxQuantにて解析した、Pathway解析データをご提供いたします。

 (SILACを用いた解析結果例)

 上図は、SILAC解析で得られたデータのLog2での倍率変化をプロットしています。
 右表にUp regulateしたタンパク質が記載されています。


 LC/MS/MSにより、重鎖、軽鎖のリン酸化ペプチドは、イオンクロマトグラム及び対応するスペクトルにおいて検出され、選択されます。


価格


サービス名 数量 税別価格 Cat.#
SILACタンパク質発現・相対定量解析サービス 1比較
(2もしくは3サンプル)
¥858,000 F-MSB-QW-SILAC
 *2サンプルの場合も3サンプルの場合も価格は同じとなります。
 *サンプル量が少ない場合は、標識確認実験などで、別途オプション料金が発生する場合があります。


ご送付サンプルについて


 QCシートを同封の上、弊社までお送り下さい。
 ご発送は、代理店へご依頼いただくか、直送願います。
 発送の際の送料は、お客様負担となります。(着払いは受け取りできませんので、ご注意ください。)
 また、土日祝祭日をはさまない様に、弊社営業日に到着する様にご発送ください。
サンプル 状態 ご送付サンプル量
細胞
(安定同位体標識化されたアミノ酸を添加した
細胞培養液を用いて、タンパク質へ標識を行ったもの)
ペレット
保存温度:-80℃以下
輸送温度:-80℃
(ドライアイス詰めで冷凍便)
1×10e6個以上
タンパク質
(安定同位体標識化されたアミノ酸を添加した
細胞培養液を用いて、タンパク質へ標識を行ったもの)
保存温度:-20℃以下
輸送温度:-80℃
(ドライアイス詰めで冷凍便)
タンパク質20ug以上
* 細胞の場合の注意事項
 ・細胞の数をQCシートに記載してください。
 ・緩衝液組成、溶液名をQCシートに記載してください。
 ・-80℃以下で保存し、発送の際は、ドライアイス詰めで冷凍便にて、弊社営業日に到着する様にご発送ください。
 ・対象生物種を指定してください。
* サンプルの発送は、必ず「サンプル送付方法およびご注意点(PDF)」をご参照の上、その内容に従って行って下さい。
* (サンプルの送付先)
 フィルジェン株式会社 バイオサイエンス部 受託解析センター宛
 〒459-8011 名古屋市緑区定納山1丁目1409番地
 Tel 052-624-4388  Fax 052-624-4389  E-mail biosupport@filgen.jp


本ページは、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、MSBioworks社のホームページに掲載されている情報や画像を一部引用させて頂いております。

お問い合わせ biosupport@filgen.jp P.052-624-4388 www.filgen.jp
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