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mRNA 合成・修飾サービス
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mRNA 合成・修飾サービス


baseclick社では、T7 RNA ポリメラーゼを用いた in vitro 転写による mRNA 合成サービスを実施しています。以下の図に示されている通り、合成 mRNA の末端や内部にアジド基やアルキンを追加した多種多様な修飾が可能です。また、5' 末端にキャップを付加することなどにより、生体内での免疫反応を回避できます。さらに、クリックケミストリーを活用し、蛍光標識等を末端や内部に結合した修飾 mRNA の合成も可能なため、幅広い修飾を施した mRNA を提供することができます。

◆mRNA 合成・修飾例
T7 RNA ポリメラーゼを用いた
in vitro 転写による mRNA 合成
転写後修飾 クリックケミストリーを用いた
バイオコンジュゲーション
内部修飾や 5'末端修飾 3'末端の修飾 蛍光色素やリンカーなどの不可

◆合成 mRNA の構造

下記の一本鎖 RNA の構造で納品されます。


◆修飾一覧
①5'末端修飾 <キャッピング>
ARCA
(Anti-Reverse Cap Analog)
5'末端に Cap 0 構造を mRNA に付加します。
※最大約 70%の効率で取り込まれます。
※T7 プロモーターの下流に開始配列 5'-GGG-3' が必要です。
Clean Cap AG 5'末端に Cap 1 構造を mRNA に付加し、生体内での免疫反応を回避します。特に in vivo での翻訳効率が大きく改善されます。
※通常 95%以上の効率で取り込まれます。
※T7 プロモーターの下流に開始配列 5'-AGG-3' が必要です。
<修飾用ジヌクレオチドの付加・バイオコンジュゲーション>
Azido-hexynul-pApG アジドヘキセニル基を 5'末端に修飾します。
※Clean Cap AG と同程度の効率で取り込まれます。
※キャップ類似体としての機能はございません。
※T7 プロモーターの下流に開始配列 5'-AGG-3' が必要です。

さらに、クリックケミストリーを利用した 5'末端修飾が可能です。以下の様な DBCO 試薬を使用して 5'末端への標的物を修飾可能です。
i) DBCO-PEG4-biotin
ii) DBCO-PEG4-Desthiobiotin
iii) DBCO-AF488
iv) DBCO-AF647
v) Tri-GalNAc-DBCO
vi) DBCO-PEG4-DBCO
vii) DBCO-PEG4-alkyne
viii) DBCO-C6-alkyne
ix) DBCO-PEG4-NHS ester
x) DBCO-C6-NHS ester
Amino-hexynul-pApG アミノヘキセニル基を 5'末端に修飾します。転写後に、アミノ基のエステル化によって、特定の分子への結合が可能となります。
※キャップ類似体としての機能はございません。
※T7 プロモーターの下流に開始配列 5'-AGG-3' が必要です。
<修飾なし>
②3'末端修飾 <修飾ヌクレオチド置換・バイオコンジュゲーション>※置換率の指定可能
5-Ethynyluridine triphosphate
(エチニルウリジン)
アルキンを有する RNA を標識するために、5-Ethynyl-UTP を使用しています。合成された mRNA にアルキン修飾ウラシルが組み込まれ、クリックケミストリーを利用した修飾が可能となります。

さらに、以下の様なアジド修飾試薬を使用した内部修飾も可能です。
i) Biotin-PEG4-azide
ii) Biotin Azide Plus
iii) AZDye 488 Azide Plus
iv) AZDye 647 Azide Plus
v) Azido-PEG4-Mannotriose
vi) Tri-β-GalNAc-PEG3-Azide
5-Methoxyuridine triphosphate
(メトキシウリジン)
自然免疫応答を低減するために、メトキシウリジンへ置換します。
5-Methylcytidine triphosphate
(メチルシチジン)
メチルシチジンへ置換します。
シュードウリジン 生体内の自然免疫を回避するため、シュードウリジンへ置換します。
N1-メチルシュードウリジン シュードウリジンよりもタンパク質の発現量が亢進される N1-メチルシュードウリジンへ置換します。
<修飾なし>
③3'末端修飾 <アジド修飾用ヌクレオチドの付加>
2'-Azide-2'-dATP mRNA の 3'末端へアジド基を組み込みます。

さらに、クリックケミストリーを利用した 3'末端修飾も可能です。以下の様なDBCO 試薬を使用した 3'末端の修飾も可能です。

i) DBCO-PEG4-biotin
ii) DBCO-PEG4-Desthiobiotin
iii) DBCO-AF488
iv) DBCO-AF647
v) Tri-GalNAc-DBCO
vi) DBCO-PEG4-DBCO
vii) DBCO-PEG4-alkyne
viii) DBCO-C6-alkyne
ix) DBCO-PEG4-NHS ester
x) DBCO-C6-NHS ester
<修飾なし>
その他ご要望等ございましたら、お気軽に弊社試薬機器部(biosupport@filgen.jp)までご相談ください。

◆QCについて

ご依頼頂いた合成品には、下記の品質チェックが実施されます。
合成 mRNA ・Qubit アッセイ(蛍光分析)による収量の定量
・A260/A280 比による純度決定
・変性アガロースゲルによる完全性の確認
修飾 ・アジド修飾とアルキン修飾ヌクレオチドの取り込みは、変性アガロース電気泳動により確認
・クリックケミストリーによる修飾は、蛍光値測定により確認

◆お見積りご依頼方法

合成依頼シートに必要事項をご記載の上、代理店または弊社 試薬機器部(biosupport@filgen.jp)までご連絡をください。合成依頼シートにご記載頂いた内容での合成の可否を提携先に確認し、お見積価格をご連絡いたします。
合成依頼シート(Excelダウンロード)

お見積りには、以下の情報が必要です。
・テンプレートの配列情報
 (RNA 鎖長、T7 プロモーター配列、5'UTR 配列、ORF 配列、3'UTR 配列、ポリ A テール配列)
・5'末端修飾の選択
・ホスファターゼ処理の有無
・内部修飾の選択
・バッファーの選択
・3'末端修飾の選択
・収量の選択

※baseclick社推奨の UTR 配列をご案内することも可能です。

◆使用例

アジド基修飾 eGFP 発現 mRNA のクリックケミストリーを使用した Cy3 蛍光検出

eGFP 発現 mRNA の in vitro 転写合成
capped eGFP 発現 mRNA の 3'末端にアジド基を付加
3'末端にアジド基が付加された capped eGFP 発現 mRNA に Cy3 標識アルキンを結合させ Cy3 標識 eGFP 発現 mRNA を作製
Cy3 標識 eGFP 発現 mRNA を細胞にトランスフェクションし、蛍光検出を実施
eGFP: eGFP タンパク質の蛍光検出画像
Cy3: eGFP 発現 mRNA の Cy3 蛍光検出画像


◆参考文献
Chemoenzymatic Preparation of Functional Click-Labeled Messenger RNA, S. Croce et al., 2020, ChemBioChem, Vol. 21, p. 1641. https://doi.org/10.1002/cbic.201900718
5-Ethynyluridine: a bio-orthogonal uridine variant for mRNA-based therapies and vaccines, S. Maassen et al., 2023, ChemBioChem, Vol. 24, p. e202200658. https://doi.org/10.1002/cbic.202200658

お問い合わせ 試薬機器部: biosupport@filgen.jp P.052-624-4388 https://filgen.jp/
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